引言

湿热灭菌是医疗、制药和生物制品行业中广泛采用的关键灭菌技术，其通过高温高压的饱和蒸汽有效灭活微生物，确保无菌产品的安全性。然而，灭菌过程的可靠性需通过科学手段验证，其中生物指示物（Biological Indicator, BI）作为直接反映灭菌效果的“金标准”，其检测与评价至关重要。本文围绕湿热灭菌用生物指示物的检测，系统介绍检测范围、项目、方法及仪器，以期为行业提供技术参考。

检测范围

湿热灭菌用生物指示物的检测主要应用于以下场景：

• 制药行业：注射剂、无菌原料药及医疗器械的灭菌工艺验证；
• 医疗机构：手术器械、植入物及高风险复用器械的灭菌效果监测；
• 实验室及研究机构：灭菌设备性能评估与新工艺开发；
• 第三方检测机构：生物指示物产品合规性认证。

检测对象通常为含有特定微生物芽孢（如嗜热脂肪地芽孢杆菌，Geobacillus stearothermophilus）的载体，其抗性需符合ISO 11138-3等国际标准。

检测项目

湿热灭菌生物指示物的核心检测项目包括：

• 菌种鉴定：确认指示物中微生物种类及纯度；
• D值测定：定量评估芽孢对湿热灭菌的耐受性；
• 存活时间（ST）与杀灭时间（KT）：验证灭菌程序的临界参数；
• 孢子含量测定：确保每单位指示物的芽孢负载量符合标准；
• 储存稳定性：评估生物指示物在有效期内的性能可靠性。

检测方法

1. 菌种鉴定

通过生化试验（如过氧化氢酶、氧化酶反应）与分子生物学方法（16S rRNA基因测序）双重验证，确保菌株为Geobacillus stearothermophilus，并排除杂菌污染。

2. D值测定

采用“分数阴性法”（Fraction Negative Method），将生物指示物暴露于不同灭菌时间梯度后培养，通过最大似然估计法计算D值（即杀灭90%微生物所需时间）。公式如下：

• D = (U - L)/n
• 其中U为全部阴性结果的最短暴露时间，L为部分存活的最长时间，n为样本数量。

3. 存活时间与杀灭时间验证

基于D值设定灭菌参数，在灭菌器内模拟实际灭菌程序，重复测试直至存活时间（ST）和杀灭时间（KT）满足ISO标准（如KT≤15分钟）。

4. 孢子含量检测

使用稀释涂布法或膜过滤法对芽孢悬液进行梯度稀释，接种至琼脂培养基培养后统计菌落形成单位（CFU），确保每片生物指示物的孢子负载量为10⁵–10⁶ CFU。

5. 储存稳定性测试

于不同温度（如25℃、40℃）和湿度条件下长期储存后，定期检测孢子存活率及D值变化，评估货架期稳定性。

检测仪器

• 微生物培养箱：提供55–60℃恒温环境，用于嗜热脂肪杆菌芽孢的复苏培养；
• PCR仪与基因测序系统：用于菌种基因水平鉴定；
• 湿热灭菌器：模拟实际灭菌条件，配备高精度温度压力传感器；
• 显微镜与流式细胞仪：观察芽孢形态及定量分析；
• 自动菌落计数仪：提升孢子含量检测的准确性与效率。

结论

湿热灭菌用生物指示物的检测是确保灭菌工艺有效性的核心环节。通过规范化的检测流程，可精准评估生物指示物的性能参数，从而为制药、医疗等行业提供可靠的无菌保障。未来，随着新型快速检测技术（如荧光标记、ATP生物发光法）的引入，检测效率与精准度将进一步提升，推动灭菌质量管理的智能化发展。

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